广州美嘉东峻医疗门诊部

问题分析：人类有23对46条染色体，染色体的数量和结构相对恒定。因为染色体的平衡易位只是改变了它的位置，没有可见的染色体或基因的增减，所以平衡易位携带者的表现型和普通人没有区别。由于染色体交换，在配子形成和胚胎形成过程中发生染色体三体和染色体片段缺失，导致不育、流产、胎儿畸形或新生儿外观和表型异常。研究表明，平衡易位携带者后代的流产率为50%，在平衡易位携带者的活后代中，因染色体不平衡而导致新生儿畸形的发生率约为6%。因此，平衡易位携带者通常经历一次或多次流产，其中大多数有两次或多次流产。为了平衡易位，这些患者会在胚胎移植(PGT)前通过基因检测选择核型正常/平衡的胚胎进行移植，以避免胚胎染色体异常导致流产或胎儿畸形。什么是染色体平衡异位？不同来源的两条染色体断裂后，发生转座，并相互重新连接，形成两条结构重排的染色体，称为相互易位。这些易位大多保留了原有的基因总数，一般不会对基因功能和个体发育产生严重影响，故称为平衡易位。平衡易位是人类最常见的染色体结构畸变，其在新生婴儿中的发生率约为1/500 ~ 1/625。罗氏易位是一种特殊类型的染色体重排，是指两条近端着丝粒染色体在着丝粒处或着丝粒附近断裂后，短臂丢失，染色体长臂融合成一条染色体，导致染色体数量减少，长臂数量不变，但减少了两条短臂的现象。罗氏易位主要发生在5条近端着丝粒染色体上(13、14、15、21、22号染色体)。人群发病率约为1/1000。平衡易位配子的类型和机制具体来说，在平衡易位染色体分离形成配子的过程中，会形成一种叫做四分体的结构。考虑到分离规律和交换重组的情况，这个四分体最终可能产生18个配子，导致只有一个完全正常的胚胎，一个表型正常的平衡易位携带者，另外16个异常胚胎。因此，染色相互易位的携带者，获得完全正常胚胎的概率只有1/18。四弹体结构通常经历三种分离模式:2∶2、3∶1或4∶0。只有2∶2模式的交替分离模式能产生正常或平衡的配子，其他分离模式都能产生不平衡的配子。平衡易位的四分体形成示意图四条染色体，两条姐妹染色单体在交汇处交换(以2号染色体和5号染色体易位为例):平衡易位携带者的配子类型示意图:但后代正常表型的概率不是2/36或1/18。这是因为每种分离类型的概率不尽相同，2:2分离比较常见，大部分是对位分离。胎儿畸形的可能性因易位染色体的位置和片段的大小而异。所以1/18是极限值，并不是所有染色体平衡易位的患者都只有1/18的希望。但总体来说，胎儿出生异常的概率在0%-30%之间，高于复发性流产的概率。如果患者有阳性家族史，他的风险会高于一般人群。如果这种平衡易位发生在女方身上，风险值为30%-40%，如果发生在男方身上，风险值将高达40%-50%，因为在自然受孕过程中，一些异常或不活跃的精子会在形成受精卵之前死亡，占优势的精子最终能与卵子形成受精卵的概率会增加。大多数染色体易位不平衡的个体会在胚胎形成或怀孕期间自然死亡。所以，如果一个正常的胎儿定期做产前超声检查，说明这个胎儿配子正常和易位的可能性很高。当然，此时最好提取绒毛或羊水进行染色体或微阵列分析，确定胎儿染色体。染色体平衡易位携带者自然妊娠风险大，主要是妊娠早期自然流产。因此，建议染色体平衡易位携带者通过人类辅助生殖技术生育，选择正常胚胎植入，规避生育风险。PGT检测难点目前，胚胎植入前的染色体筛查多用于筛查因易位导致遗传物质不平衡的胚胎。如何进一步区分易位携带者和完全正常胚胎还存在一些问题:1)需求/伦理:携带者具有正常的表型，平衡易位导致临床正常出生的概率高于理论的1/9，而且这个概率还会受到包括哪两条染色体、断点的位置、染色体易位携带者的性别等因素的影响；2)技术局限:平衡易位携带者不存在基因丢失，一般高通量测序和芯片技术很难区分易位胚胎和完全正常胚胎；3)检测困难:难以确定断裂点的确切位置，给后期胚胎分化带来困难。指南和共识由于还没有非常成熟的技术，目前国内外协会还没有出台关于易位胚胎分化的指南或专家共识；由于易位胚胎染色体的特殊性，目前仅用一种方法无法区分正常胚胎和易位胚胎。2010年，ESHRE(欧洲人类生殖与胚胎学学会，欧洲人类生殖与胚胎学学会)出版了基于荧光原位杂交的PGD最佳实践指南。仅基于荧光原位杂交的PGD技术不足以区分正常和平衡易位胚胎。2013年，ACOG(美国妇产科学院，美国妇产科学院)发表了《染色体微阵列分析在产前诊断中的应用推荐》，指出单靠CGH技术无法识别平衡易位。国内外常用的易位携带胚胎PGT检测技术主要有以下几种方法:循环文库构建双端测序法、显微切割法、核型定位法和单精子检测/废胚胎暴露断裂点法。1.环化文库构建的双端测序法的技术原理。双端测序可以通过将插入的DNA片段插入到文库中的一个循环中，并对其进行测序，从而获得插入DNA片段的末端信息。通过双端测序，找到了父母染色体平衡易位携带者断点的位置信息。根据断裂点的上下游序列设计特异性引物，用引物对胚胎单细胞的全基因组扩增产物进行PCR验证，从而判断胚胎是否存在断裂点。其实现仍基于第二代测序技术的个体化设计，为易位胚胎的鉴定提供了新的方法。总体流程:配对数据库构建的原理和技术特点:通过双端测序准确定位染色体平衡易位的断点，为每个患者设计引物，结合高通量测序技术对胚胎进行倍性筛选后，进一步鉴定正常胚胎和易位胚胎。技术限制需要大量数据进行测序，高度重复区域无法检测；此外，在受精卵形成过程中，胚胎的断点位置可能会发生微小的变化，这也可能导致断点无法识别的情况。2.显微切割技术原理:利用染色体显微切割技术获得易位染色体断点附近的染色质，然后利用高通量测序技术精确定位断点。高通量测序技术的测序信息有利于平衡易位染色体的后续分析。例如，这些信息可以用于设计引物，对平衡易位携带者的胚胎进行PGD诊断，区分完全正常的胚胎和易位胚胎，以及通过仅移植完全正常的胚胎来阻断该家族中平衡易位染色体的传播。整个实验分为前实验和正式实验两部分。在预实验部分，通过染色体平衡易位携带者的核型分析、显微解剖、高通量测序和第一代测序获得准确的断点位置，确定断点的上下游SNP位点进行连锁分析。在实验的正式部分，对胚胎进行了PGT-A检测。首先，排除可以确定为不平衡易位的异常胚胎。然后通过PCR方法检测剩余胚胎样本中是否存在断点(结合SNP连锁分析)，最终筛选出完全正常的胚胎。前形式实验1的技术特征。通过微切割技术，通过比较可以从两个方向逼近断点，准确率高，测序成本低；2.通过预实验可以获得准确的断裂点位置；3.正式实验周期短(2-3周)；4.通过PCR和断裂点SNP连锁分析的双重保险鉴定正常胚胎。技术局限性由于微切削是手工操作，这种方法对操作者的技能有一定的要求。3.核型作图原理。核型作图是基于SNP芯片的PGT技术。其原理是通过比较胚胎、父母和近亲的DNA样本，对平衡易位受试者进行基因分型，然后通过连锁分析构建携带者家族的全基因组单体型，分析不平衡易位胚胎的单体型确定断裂点，通过定位其是否携带易位单体型和易位断裂点区域是否发生同源重组来判断胚胎的染色体状态，从而实现正常胚胎和易位胚胎。特点1)有配套的分析软件，对数据分析要求简单；2)SNP位点覆盖了全基因组的23对染色体；3)通过大规模样本SNP芯片检测即可获得所需信息，无需单独设计SNP连锁分析；4)可以分析罗氏易位和平衡易位；5)检测相对简单，适合常规临床实验室。局限性因为它是固定的SNP探针，在一些平衡易位断点周围可能没有可用的SNP信息。4.单精子测序/废胚暴露断裂点法的技术原理。如果活检时同时出现正常胚胎、易位胚胎和染色体不平衡的胚胎，首先要对这些异常胚胎进行高通量测序，进一步通过生物信息学分析这些胚胎中的异常拷贝数变异，确定断点，构建断点上下1Mb以内的SNP单倍型，最后区分易位胚胎和正常胚胎。在另一种方案中，针对男性的平衡易位，所采用的检测方案在技术上主要依靠单精子检测技术，即比较易位重复精子和易位缺失精子的SNP信息，得到正常精子的单倍型，再结合女性相应位置的纯合SNP信息，最终区分携带者和正常胚胎。根据男性平衡易位携带者胚胎检测方案的技术特点，1)准确性高:该技术中单细胞全基因组扩增技术扩增均匀性好，等位基因脱扣率低，诊断准确性高；2)操作简单:通过精子或染色体异常的废弃胚胎寻找染色体断裂位点，操作更简单；3)适用范围广:对于所有平衡易位类型和罗氏易位，该技术可以区分正常胚胎和易位胚胎，适用范围更广。技术的限制对胚胎类型有一定的要求。只有当活检中存在染色体不平衡的胚胎时，才能以暴露的断点为参照实现检测。5.底图方案内容底图方案是易位胚胎检测的整体解决方案，包括微切割技术、核型定位技术、DNA环化数据库构建结合高通量测序技术。原理该技术涉及的DNA环化数据库构建和测序技术主要是收集平衡易位携带者的细胞样本，对样本DNA进行片段化后环化，通过特殊技术获得环化接触点位置的DNA序列，通过高通量测序和数据分析识别平衡易位的断点，通过长序列PCR技术验证断点信息；此外，实验者会根据断裂点的上下游信息找到合适的SNP位点信息，最后利用断裂点信息结合SNP单倍体分析来区分正常胚胎和平衡易位携带胚胎，从而阻断平衡易位的传播。技术优势1)精确断点定位:选择最合适的检测技术，完成精确断点定位；2)方案选择灵活:BaseMapping提供的不同技术方案可以满足患者和医疗机构的不同需求。3)样本的完全适用性:该方案完全适用于平衡易位、罗氏易位和倒位携带者的PGT检测。